研究背景
基因组靶向编辑是指在生物细胞的基因组DNA的预定位点上，精确地引入DNA序列的变化，包括碱基的插入、缺失和DNA序列交换等，进而改变基因的结构或功能(Perez-Pinera et al., 2012)。早在1988年，Paszkowski等(Paszkowski et al., 1988)首次尝试利用基于同源重组的基因打靶技术成功修复了预先在烟草基因组中人为引入的缺失功能的外源基因(APHII)，揭开了人们在植物基因组靶向编辑的序幕。此后该技术在小立碗藓(Physcomitrella patens) (Schaefer and Zrÿd, 1997)、烟草(Nicotiana tabacum L.) (Lee et al., 1990)、拟南芥(Arabidopsis) (Hanin et al., 2001)、百脉根(Lotus japonicas) (Thykjær et al., 1997)、水稻(Oryza sativa L.) (Terada et al., 2002)等多种模式植物内源基因的编辑中得到成功应用，但是，由于该技术效率很低(在10-5~10-3之间) (Iida and Terada, 2005)，严重制约了该技术在高等植物中的广泛应用。

随后，科研人员根据真核生物转录调控因子-ZFP (Zinc finger protein,锌指蛋白)和植物病原菌的一类分泌蛋白-TALE (Transcription activator-like effector,转录激活效应子样效应因子)分别开发出了ZFNs和TALENs技术；以及最近基于原核生物的适应性免疫系统而开发出的CRISPR-Cas9技术，前两种技术通过特异的DNA结合蛋白与DNA靶位点结合，在非特异性的核酸酶FokⅠ的作用下引起生物基因组靶位点DSBs。而CRISPR-Cas9则通过小分子向导RNA (small guide RNA)以碱基互补配对方式与DNA序列靶位点结合，引导Cas9蛋白到靶位点并对DNA产生剪切作用，从而造成基因组靶位点DSBs，形成的DSBs会启动真核细胞DNA修复机制。通过两种方式NHEJ (non-homologous end joining,非同源末端连接)和HR (homologous recombination,同源重组)修复断裂缺口(Wyman and Kanaar, 2006)，在修复时可能会引起DNA序列的插入、缺失或置换等，从而实现基因组靶向编辑，大大提高了植物基因编辑的效率和简化了实验操作，在植物基因功能研究和农作物改良中展现出广阔的应用前景。本综述详细介绍这三种技术的基本结构及其进行基因组靶向编辑的原理和比较其特点，并着重介绍了三种技术在植物中的应用进展，并对其进一步发展提出了展望。
 

1 ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas技术的结构、原理及特点
1.1 ZFNs技术
ZFNs是由人工构建的锌指蛋白(zinc fingers proteins, ZFPs)和非限制性核酸酶FokⅠ两部分组成(Bibikova et al., 2002)。ZFPs是一类真核生物中普遍存在的基因转录调控因子，在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育和增强植物抗逆性等方面起非常重要的作用(宋冰等, 2010; Liu et al., 2011; Yu et al., 2014; Zang et al., 2015)。

每个锌指蛋白由多个锌指结构域组成，其中Cys2-His2 (C2H2)型锌指结构域在转录调控因子中广泛存在。Miller等(Miller et al., 1985)最早发现并阐述了C2H2型锌指结构域的功能，在全长为344个氨基酸的转录因子TFIIIA序列中，13~276位氨基酸含有9个锌指结构域，每个锌指结构域由30个氨基酸组成，每个锌指结构域中8和13位的半胱氨酸(cysteine, Cys)以及26和30位的组氨酸(histidine, His)非常保守，他们络合锌离子形成稳定的指形结构，并折叠成α-β-β二级结构。

锌指蛋白特异识别和结合DNA是由于锌指的α-螺旋嵌入到DNA分子的大沟中直接同核苷酸的碱基发生作用，α-螺旋上的-1~+6位上的氨基酸残基赋予了锌指对DNA识别的特异性，其中-1、3、6氨基酸可以识别位于DNA同一条链上3′到5′方向连续的3个碱基(Pavletich and Pabo, 1991)。这样每个锌指单元可以识别3个连续的碱基，理论上替换锌指α-螺旋上关键的氨基酸残基，保持锌指的基本骨架不变，就可以产生识别不同序列的特异锌指单元。将这些单元串联在一起就可以形成与长DNA序列结合且具有特定靶向性的锌指蛋白。人工构建的锌指蛋白通常由3~6个C2H2型锌指单元串联组成，识别DNA链上相连续的9~18 bp碱基，锌指核酸酶的另一个组成元件是非特异的FokⅠ核酸酶，该酶是IIS型的限制性内切酶，只在二聚体状态时才具有酶切活性(Bitinaite et al., 1998)，每个锌指蛋白与FokⅠ融合构成一个锌指酶单体(ZFN)，识别特定的DNA位点。当两个单体识别的DNA位点相距合适的距离时(6~8 bp)，两个锌指酶单体产生酶切功能，从而对DNA双链产生剪切并引起靶位点DSBs。DSBs诱发真核细胞的DNA损伤修复机制，通过NHEJ修复DSBs，可能造成在DNA靶位点随机性的碱基的插入或缺失等，引起基因序列的改变，从而实现基因的靶向敲除。如果细胞中存在与靶位点附近序列同源的DNA片段，也可能通过HR来修复DSBs，引起DNA序列的插入或互换，从而实现基因敲除或敲入(Gaj et al., 2013)。

目前，人们已经开发出多种设计和组装锌指核酸酶的方法，如：模块组装法(modular assembly, MA) (Wright et al., 2006)；OPEN法(oligomerized pool engineering, OPEN) (Maeder et al., 2008)和CoDA (context dependent assembly system, CoDA) (Sander et al., 2011)，此外，还有一些商业公司开发的方法，如Sangamo Biosciences公司开发的具有知识产权的双锌指模块组装方法等等。但是不管哪种方法，锌指核酸酶合成和组装程序都比较复杂，价格较贵，一般实验室较难实施。

1.2 TALENs技术
TALENs是继ZFNs之后的另一种较为灵活和高效的靶向编辑技术(Beumer et al., 2013; Chen et al., 2013)，TALENs在结构上与ZFNs类似，是由特异性的DNA结合蛋白-TALE蛋白和FokⅠ核酸酶两部分组成(Christian et al., 2010)。TALE蛋白是植物病原体-黄单胞菌(Xanthomonas spp.)分泌的一种转录激活子样效应因子，是一类分泌蛋白，在植物细胞中能够特异性地识别并结合寄主靶基因的序列，从而调控寄主的基因表达(Boch and Bonas, 2010)。

TALEs蛋白分子结构包含有N-端转运信号(Translocation signal)；C-端含核定位信号NLSs (Nuclear localization signals)和酸性转录激活域AD (Acidic activation domain)；以及中间串联重复区，中间的串联重复区则由多个串联排列的重复序列单元组成，每个重复序列单元一般含33~35个高度保守的氨基酸，其中第12和13位氨基酸可变，被称为重复可变双残基RVD (Repeat-variable di-residue) (Boch and Bonas, 2010; 赵开军和杨兵, 2012)，研究发现TALEs的RVD可特异性识别DNA碱基，其规律为：NI识别A，NG识别T，HD识别C，NK识别G，NN识别G或A，NS可识别A，C，G，T(Boch et al., 2009; Moscou and Bogdanove, 2009)。

基于TALEs蛋白中的RVD的两个氨基酸特异识别和结合一个碱基的原则，因此，如果TALE要特异识别和结合某一核酸序列(靶位点)，理论上可以按照靶位点的序列，将多个对应TALE重复单元经过串联就可以定制出特异识别DNA序列的TALE蛋白，在TALE蛋白的C端融合一个非特异的核酸内切酶FokⅠ就构成了可以用于靶向基因组编辑的TALEN单体。TALENs技术对生物基因组特定位点产生剪切作用与ZFNs类似，由两个TALE蛋白识别和结合DNA靶位点，FokⅠ核酸酶负责对靶DNA进行切割，从而造成DNA的DSBs，诱发细胞的DNA损伤修复机制，从而实现对基因组靶位点的编辑。

TALENs的合成与组装相对于ZFNs要简单和灵活，其关键是要合成TALE蛋白串联重复区的编码DNA序列，理论上将多个TALE重复单元编码的DNA序列通过多次连接即可实现，但是要合成这种高度重复序列也具有一定的困难和挑战。目前，已经开发出多种快速、简便合成和组装TALENs方法，如Golden gate (GG)组装法(Weber et al., 2011; Zhang et al., 2011)，快速高通量固相合成法(Fast Ligation-based Automatable Solid-phase High-throughput, FLASH) (Reyon et al., 2012)和基于长粘末端的LIC (Ligation-independent cloning)组装方法(Schmid-Burgk et al., 2013)等。

1.3 CRISPR-Cas技术
CRISPR-Cas是2013年出现的由小分子RNA介导的一种靶向基因组编辑新技术，该技术是基于原核生物(细菌和古菌)一种免疫系统而开发的，称之为Clustered regularly interspaced short palindro- mic repeats-CRISPR-associated proteins (规律成簇间隔短回文重复及其相关蛋白)，简称CRISPR-Cas系统(Sorek et al., 2008; Charpentier and Doudna, 2013)。由于该技术合成简单、周期短、操作灵活、效率高等优点，目前备受人们关注。

CRISPR-Cas系统是一类广泛分布于原核生物基因组的重复结构，由不连续的高度保守的正向重复序列(Repeat, R)与长度相近的间隔序列(Spacer, S)排列组成的R-S结构，称之为CRISPR基因座(CRISPR locus)，在R-S结构第一个重复序列上游是前导序列(Leader)，作为启动子可以启动CRISPR基因座的转录，在CRISPR基因座附近还存在一些保守的CRISPR相关蛋白基因(cas gene)。因此，由Cas蛋白基因、前导序列和CRISPR基因座共同构成CRISPR-Cas系统(Horvath and Barrangou, 2010) (图1)。

图1 CRISPR基因结构 注: S1, S2, Sn分别表示不同的间隔序列(Spacers); R表示同向重复序列(Repeats) Figure 1 The structure of CRISPR gene Note: S1, S2 and Sn represent different Spacers respectively; R represents Repeat

 
CRISPR-Cas系统能够降解入侵的噬菌体、质粒等外源核酸物质，使原核生物(细菌和古菌)具有适应性免疫能力，根据参与作用的Cas蛋白基因的序列和结构特点，CRISPR-Cas系统可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三种类型(Makarova et al., 2011; Wiedenheft et al., 2012)，其中Ⅰ和Ⅲ型CRISPR-Cas系统需要多种蛋白质参与才能形成具有功能的Cas蛋白复合体(Brouns et al., 2008; Liu and Fan, 2014)，而来自于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Ⅱ型的CRISPR-Cas是三种类型中最简单的系统，仅需要一种Cas9蛋白(Garneau et al., 2010; Zhang et al., 2014)。在该系统中，入侵的外源核酸片段作为间隔序列(Spacer)在前导序列与第一段重复序列之间的位置，整合到CRISPR locus中，然后转录成长链的CRISPR RNAs前体物(pre-crRNAs)，与tracr RNA(trans-activating crRNA)部分互补配对，然后在Cas9/RNAseIII加工下形成成熟的tracr RNA：crRNA复合物，通过crRNA与入侵DNA上原间隔序列(Proto-spacer)碱基互补配对，从而引导Cas9蛋白到原间隔序列的区域，该过程需要在靶标DNA上有一段保守的PAM（Protospacer adjacent motif)序列，对于Ⅱ型CRISPR系统一般为5′-NGG-3′序列。然后Cas9酶的HNH剪切域切割与crRNA互补的DNA链，RuvC-like域则剪切非互补的DNA链，从而造成该位点的DSB，降解入侵噬菌体核酸或质粒(Liu and Fan, 2014)。
 

2012年，Jinek等(2012)报道了将crRNA和tracrRNA的序列通过4个碱基环形结构相连构成一个嵌合的sgRNA (small guide RNA)分子，通过体外实验证明了该sgRNA能使Ⅱ型系统的Cas9蛋白能够识别特定的DNA序列，并引起DNA的DSBs，为以后CRISPR-Cas系统应用于基因组靶向编辑开创了里程碑的工作。2013年2月，两个实验室分别利用该技术成功对人和小鼠细胞的内源基因实现靶向编辑(Cong et al., 2013; Mali et al., 2013)，此后，该技术在其他物种的应用也竞相报道。

目前，基于Ⅱ型的CRISPR-Cas9系统而改造的基因组编辑技术只需要根据靶DNA位点合成一段能够编码大约100 nt sgRNA的序列和一个Cas9蛋白两种主要元件。对不同的基因位点，仅需要改变编码sgRNA的序列，而不用重新构建或表达Cas9蛋白，并且可以将多个sgRNA串联可以对一个基因的多个位点进行编辑或同时对多个基因进行编辑，也可以在RNA水平上进行编辑(O’Connell et al., 2014)。CRISPR-Cas9基因组编辑载体的构建也非常简单、快速，通过常规的酶切、连接和克隆可在1~3天就完成构建工作，大大简化实验，在普通分子生物学实验室就能实施。

1.4三种基因组靶向编辑技术的特点
ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas技术在DNA靶点识别和结合域、剪切域、靶序列的大小、设计难易程度、靶向修饰效率、脱靶率、多位点编辑难易程度、构建所需要的时间和成本等方面进行比较(Fichtner et al., 2014; Chen and Gao, 2014) (表1)。CRISPR-Cas9无论是在设计、构建难易程度，还是时间、成本，以及修饰效率上，显然优于TALENs和ZFNs两种技术，但是CRISPR-Cas9也存在自身的局限性，比如选择DNA靶位点受限于PAM序列不能对基因的任何位点进行编辑，另外还存在一定的脱靶效应等问题。

表1 ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas9技术特点的比较 Table 1 Comparison of ZFNs, TALENs and CRISPR-Cas9

 
2 ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas技术在植物中的应用进展
2005年，Lloyd等(Lloyd et al., 2005)将包含热激启动子驱动的ZFNs编码基因和该ZFN的靶向识别序列的载体转入拟南芥基因组，然后通过热激处理T1代转基因苗，促使编码ZFNs的基因表达，造成ZFN识别的靶位点序列的突变，第一次证明ZFNs可以在植物体内正常工作。随后也在拟南芥(Zhang et al., 2010)、烟草(Townsend et al., 2009)、玉米(Shukla et al., 2009)、大豆(Curtin et al., 2011)等植物内源基因的靶向编辑上得到成功的应用(表2)，但是由于该技术合成组装难度大、修饰效率低、脱靶效应高等问题使其在植物中的应用进展缓慢。

2009年，黄单胞菌效应子蛋白TAL效应子与寄主靶基因DNA特异识别的分子密码的破译，使植物基因组靶向编辑呈现新的曙光(赵开军和杨兵, 2012)，2010年，Christian等(2010)首先通过酵母实验证明TALENs的活性，并构建TALENs对拟南芥ADH1基因进行了靶向编辑，随后，Cermak等(2011)利用高效Golden Gate方法构建TALENs，在拟南芥原生质体中对ADH1进行了编辑，同年，Mahfouz等(2011)优化了TAL效应子Hax3的基因序列，然后与核酸酶FokⅠ的DNA切割域的编码基因融合组成杂合核酸酶dHax3.N，将携带有35S::ATG.EBE.TGA.spacer.EBE::uidA和35S::dHax3.N双元载体的农杆菌共浸染烟草叶片进行瞬时表达，也证明了TALENs能够在植物细胞内对靶基因进行定点剪切。2012年，Li等(2012)利用TALENs技术将水稻感病基因Os11N3(或称为OsSWEET14)启动子序列进行靶向编辑，使水稻白叶枯病原菌TAL效应子AvrXa7和PthXo3失去对Os11N3启动子靶点序列的识别，从而使水稻的抗病能力提高，展示了该技术在作物改良中的广阔应用前景。随后TALENs也成功对烟草(Zhang et al., 2013)、短柄草(Shan et al., 2013b)、小麦(Wang et al., 2014)、大豆(Haun et al., 2014)等多种植物内源基因进行编辑(表2)。

2013年，基于原核生物Ⅱ型CRISPR-Cas9系统而开发的一种新的靶向基因组编辑技术的出现，给基因工程带来技术性的革命(Zhang and Zhou, 2014)，相对比ZFNs和TALENs该技术更简单，直接和高效等优点，其应用和发展非常迅速。在2013年8月的《Nature biotechnology》期刊上三篇文章分别报道了利用CRISPR-Cas9技术对单子叶植物水稻、小麦和双子叶植物烟草、拟南芥的多个内源基因成功进行靶向编辑，Shan等(2013a)利用该技术对水稻的4个基因(OsPDS; OsBADH2; Os02g23823和OsMPK2)和小麦1个基因(TaMLO)进行定点突变，在转基因水稻中基因突变效率为4.0%~9.4%，并在T0代就可获得PDS基因敲除的水稻纯合突变体，还实现了利用HR修复途径在特定突变位点精确插入一段包含的两个限制性酶切位点的序列；展示了该技术在重要粮食作物中的应用前景；Li等(2013)利用该技术分别在拟南芥和本氏烟中实现了靶基因的定点突变, 突变效率为1.1%~38.5%之间，分别成功对两个基因(AtRACK1b和AtRACK1c)和同一个基因(AtPDS3)的两个不同位点同时进行编辑；Nekrasov等(2013)利用CRISPR-Cas技术在本氏烟中实现了基因组的定点突变,突变效率为1.8%~2.4%；同年，北京大学瞿礼嘉实验室(Miao et al., 2013)利用该技术对水稻的叶绿素加氧酶基因1(CAO1)和散生基因(LAZY1)进行定点突变，突变效率分别高达83.3%和91.6%；中科院上海植物逆境生物学研究中心朱健康实验室(Feng et al., 2013)利用CRISPR-Cas技术分别对拟南芥和水稻实现了基因的定点突变,突变效率(除了一个位点突变效率为5%外)比较高，在26%~84%之间。此外，该技术还成功对西红柿(Brooks et al., 2014)、甜橙(Jia and Wang, 2014)等多种植物内源基因进行编辑(表2)，目前该技术已成为了植物研究的一种热门手段，本实验室也正在利用该技术在水稻基因功能研究中开展相关工作。

表2 ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas9在植物中基因组靶向编辑的例子 Table2 Examples of plant targeted genome editing by ZFNs, TALENs and CRISPR-Cas9

 
3问题和展望
靶向基因组编辑技术是植物基因功能解析和农作物改良中最直接的手段，近年，随着高通量DNA测序技术的发展以及众多植物基因组测序工作的完成，通过基因组靶向编辑可以直接在基因组特定位点实现基因序列的改变以阐明基因的功能，另一方面，可以应用该技术对一些控制重要农艺性状的基因进行编辑来改良或改造农作物，并可在后代的自交或回交等中较容易去除转基因的成分，既可以避免常规转基因技术基因插入位点的不确定性，还可以避免常规转基因作物存在的生态和食品安全风险，有望成为农作物转基因育种的新方法。

ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas技术在以上两个方面都展现出了较好的应用前景，在经过长期探索，三种技术得到优化和发展，但仍然存在一些问题需要解决和探讨：1)都存在脱靶效应，如何避免脱靶效应和增加其特异性？一方面可能继续对靶向编辑技术中DNA结合域特异识别DNA的分子机制进行进一步深入研究，优化或改进基因组靶向编辑载体使其特异性更高，另一方面可以通过高通量的方法(如测序技术、生物信息学等)预测和筛选最合适的靶位点，以尽量避免可能的脱靶效应，例如在CRISPR-Cas系统设计sgRNA靶序列识别位点时，针对一些模式植物已经有网站可以查找和设计较为合适的靶位点和预测可能脱靶位点(Lei et al., 2014)；2)目前基因组靶向编辑的组成元件转移到植物细胞中最常用的方法为农杆菌Ti质粒介导法，存在浸染效率不高和物种限制等问题，而一些植物病毒(如双生病毒等(Baltes et al., 2014))具有浸染效率高和宿主范围广等优点，将来可能可以改造成为运载这些元件的有效、简单的工具；3)作为“明星”的CRISPR-Cas9技术存在sgRNA识别位点受限于PAM序列的问题，因此不能识别基因组任意位点，大大限制其应用，而Ⅲ型CRISPR-Cas系统识别位点不受PAM的限制, 靶位点选择上更自由(李君等, 2013)。因此,今后对CRISPR/Cas系统进行更深入的研究和探索，使该技术具有更广泛的适用性。相信在不久的将来，随着对人们对生物世界的深入的探索和认识，高效、特异、简单的基因组靶向编辑技术将会在植物研究领域大放光彩。

作者贡献
廖鹏飞完成论文初稿的撰写和修改；聂旺、余雅心和童普国参与参考文献查找和整理以及图表绘制；李绍波和朱友林指导论文撰写和修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(31260313)和江西省自然科学基金(20132BAB204012)共同资助。

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